实验室研究团队在Nature Communications发表最新研究成果：首次揭示氨氧化细菌氨单加氧酶高分辨电镜结构及其氨氧化分子机制
近日，华东师范大学河口海岸全国重点实验室滨海湿地微生物生理生态研究团队，联合清华大学、南方科技大学研究团队，运用多学科交叉技术手段，基于从河口湿地分离获得的一株氨氧化细菌，成功实现了氨单加氧酶在该菌自身细胞内的原位表达。研究团队通过分离纯化该蛋白复合物，在国际上首次解析了氨单加氧酶复合物在自然状态下的高分辨率冷冻电镜结构，从而在原子层面揭示了其催化氨的分子机理。相关工作以Structural insights into the catalytic mechanism of ammonia monooxygenase为题在线发表在国际权威刊物Nature Communications上。华东师范大学河口海岸全国重点实验室2025届博士生毛铁墙、南方科技大学杨肖云助理教授和李宗强助理教授为共同第一作者；华东师范大学河口海岸全国重点实验室董宏坡研究员、清华大学隋森芳院士、南方科技大学李宗强助理教授为共同通讯作者。
氨氧化作为硝化过程的限速步骤，主要由氨氧化微生物（包括氨氧化古菌、氨氧化细菌以及全程氨氧化细菌Comammox）驱动，将氨转化为亚硝酸盐，在全球氮循环中具有关键地位。与其他氨氧化微生物相比，氨氧化细菌在高氨环境中（如施肥土壤、湖泊、河流、河口及近岸海域）往往占据主导。值得注意的是，氨氧化细菌在氨氧化过程中会释放大量温室气体N2O，从而对全球变暖产生显著的正反馈效应。氨氧化的第一步是在铜依赖的氨单加氧酶催化下，将氨氧化为羟胺（NH2OH），其反应式为：NH3 + O2 + 2e- + 2H+ → NH2OH + H2O。前人研究表明，氨氧化细菌的氨单加氧酶由AmoA、AmoB和AmoC三个亚基组成。然而，由于该酶复合物结构复杂、难以实现异源表达，且从氨氧化细菌自身细胞中分离纯化极为困难，长期以来一直未能获得其高分辨率蛋白结构，导致对其催化氨的分子机制认识不清，也严重制约了通过结构改造对其进行功能优化的可能。
华东师范大学河口海岸全国重点实验室滨海湿地微生物生理生态研究团队，联合清华大学与南方科技大学的研究团队，采用多学科交叉技术，基于从河口湿地分离得到的一株氨氧化细菌，构建了其遗传表达体系，实现了氨单加氧酶在自身细胞内的原位表达。通过分离纯化该蛋白复合物，研究团队在国际上首次解析了氨单加氧酶在自然状态下的高分辨率冷冻电镜结构（图1），从原子层面揭示了其催化氨的分子机制（图2）
基于冷冻电镜单颗粒分析，研究团队发现氨单加氧酶是一个由五种亚基组成的圆柱形同源三聚体，并新鉴定出跨膜蛋白AmoD和可溶性蛋白AmoE，推测其分别参与氨氧化过程的信号转导与复合物的膜内组装。结构分析显示，三个模拟铜离子及其邻近水分子构成的氢键网络，可能有助于质子从周质侧的CuB经由内膜活性位点CuD实现高效转移，其中CuC与CuD很可能协同催化底物反应。此外，该复合物独特的表面电荷特征提示其在捕获氨及反应中间体转运中起关键作用。通过生物化学实验，团队进一步证明泛醇（CoQ10H2）可作为恢复氨单加氧酶体外活性的潜在电子供体。 上述研究成果从原子水平系统阐释了氨单加氧酶催化氨氧化的分子机理，不仅为该酶的结构改造提供了理论依据，也为开发特异性抑制剂以调控氨氧化细菌的活性奠定了重要基础。
图1. 来自N. halophila ZJB1的AMO整体结构。N. halophila ZJB1中氨单加氧酶（AMO）的总体结构。a. AMO的冷冻电子显微镜密度图。以三个相互垂直的视角呈现，不同颜色分别表示不同的AMO单体。脂质密度以灰色显示。b. AMO单体的原子模型。该图以透明的表面形式呈现，且AMO的各组成部分用颜色编码以增强清晰度。c. AMO的五个组成部分。展示了AmoD和AmoE的序列和二级结构，虚线表示本研究中建模的区域。TM，跨膜；H，螺旋。d. 对纯化AMO样本的脂质组学数据的分析。根据脂质头部类型、脂质尾部的不饱和程度以及脂质尾部的长度对脂质进行分类。已鉴定的脂质类型包括游离脂肪酸（FFA）、单酰甘油（MG）、二酰甘油（DG）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂乙醇胺（PE）、溶菌-神经酰胺磷脂乙醇胺（LNAPE）以及其它未鉴定的脂质。e. 展示代表性脂质，并叠加相应的冷冻电子显微镜密度图。
图2 铜中心与水分子介导的氢键网络。a. 在 AMO单体中解析出的三个铜位点。虚线表示图（h）中所示的横截面。b. CuB位点及其配位环境。c. 在疏水通道内同时存在CuC和CuD位点。在位于 CuC和CuD之间两个水分子下方观察到一个未识别的棒状密度。d-e. CuC（d）和CuD（e）位点及其配位环境。f. 从 CuB到CuD的质子转移通过水介导的氢键网络进行，这有助于电子的传递。原子间距离显示CuB到CuC的直接距离为19.2Å。底物结合位点以红色圆圈突出显示。g. 野生型（WT）和单拷贝突变体 N. halophila ZJB1菌株的氨氧化活性。h. CuC和CuD位于由五个螺旋形成的疏水通道的上部。i. 比较序列分析显示，氨氧化菌（AOB）和甲烷氧化菌（MOB）的AmoC与PmoC蛋白中TM5区域具有高度保守性。来自AOB（N. halophila ZJB1和N. europaea）以及MOB（M. capsulatus Bath与Methylocystis sp. Rockwell）的序列比对表明，位于TM5扭曲区域内负责配位CuD位点的残基在所有菌株中均保守。
研究得到了国家自然科学基金和深圳市科学技术和创新委员会项目的资助。
文献信息：
Xiaoyun Yang†, Zongqiang Li†*, Tieqiang Mao†, Chaofu Ma, Guo-Hao Chen, Hong-Po Dong*, Sen-Fang Sui*. Structural insights into the catalytic mechanism of ammonia monooxygenase. Nature Communications.